中藥復(fù)方通過(guò)TMEM131-TNF通路調(diào)控MDSCs細(xì)胞分化延緩結(jié)直腸癌

一、研究背景：

1、流行病學(xué)與臨床需求

結(jié)直腸癌（CRC）是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，呈“腺瘤-腺癌"連續(xù)演變模式。傳統(tǒng)干預(yù)以手術(shù)、化療、靶向及免疫治療為主，但復(fù)發(fā)率高，且對(duì)早期腺瘤的化學(xué)預(yù)防手段有限。前期多中心隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)，中藥復(fù)方“參白解毒湯"（SBJDD）可安全、有效地降低結(jié)直腸腺瘤復(fù)發(fā)率，然其微觀機(jī)制尚未闡明。

2、科學(xué)問(wèn)題

腫瘤微環(huán)境（TME）在CRC啟動(dòng)與進(jìn)展中起決定性作用。單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）已揭示TME內(nèi)免疫抑制性髓系細(xì)胞積聚，但：

1）在“腺瘤-腺癌"演變過(guò)程中，免疫抑制性樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）亞群如何動(dòng)態(tài)分化？

2）高膽gu醇等代謝因素是否驅(qū)動(dòng)該分化？

3）中藥復(fù)方能否通過(guò)多組分、多靶點(diǎn)重塑TME、阻斷癌變？

上述問(wèn)題成為本研究的核心切入點(diǎn)。

二、研究方法

1、模型體系

1）動(dòng)物：Apc^Min/+自發(fā)CRC小鼠，高脂飲食12周模擬人類“腺瘤-腺癌"演進(jìn)。

2）臨床：3例多發(fā)結(jié)直腸腺瘤患者，服藥前后配對(duì)活檢。

2、技術(shù)流程

1）scRNA-seq：10x Genomics平臺(tái)，構(gòu)建48, 992（小鼠）及39, 500（人）單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。

2）多組學(xué)整合：

? 拷貝數(shù)變異（InferCNV）判定上皮惡性程度；

? AUCell、CIBERSORT 對(duì)TCGA-COAD大隊(duì)列進(jìn)行細(xì)胞豐度反卷積；

? CellChat 解析細(xì)胞間通訊。

3）體外功能實(shí)驗(yàn)：

? 膽gu醇+LPS誘導(dǎo)“耗竭型"CCL22+ DC；

? 流式、ELISA、共培養(yǎng)系統(tǒng)驗(yàn)證其免疫抑制功能。

4）分子機(jī)制：

? qRT-PCR、Western blot、SPR、分子對(duì)接鎖定TMEM131–小檗堿（berberine）相互作用；

? shRNA敲低驗(yàn)證TNF信號(hào)軸。

3、藥效學(xué)驗(yàn)證

1）體內(nèi)：Apc^Min/+小鼠灌胃SBJDD 12周，記錄腫瘤負(fù)荷、免疫浸潤(rùn)。

2）體外：人源及鼠源CCL22+ DC回輸實(shí)驗(yàn)，評(píng)估SBJDD療效可逆性。

三、研究?jī)?nèi)容

1、構(gòu)建跨物種、跨階段的TME單細(xì)胞圖譜

1）定義40種小鼠細(xì)胞亞型、17種人細(xì)胞亞型；shou次在腺瘤階段即發(fā)現(xiàn)CCL22+ DC顯著富集。

2、追蹤C(jī)CL22+ DC發(fā)育軌跡

1）偽時(shí)間分析顯示其由Wdfy4+DC經(jīng)TNF信號(hào)驅(qū)動(dòng)分化而來(lái)，伴隨抗原提呈（MHC-II）下調(diào)、共刺激分子（CD80/86）上調(diào)，表現(xiàn)為“功能耗竭"。

3、解析CCL22+ DC介導(dǎo)的免疫抑制環(huán)路

1）CCL22-CCR7軸趨化CD4+Foxp3+Treg；

2）CD80/86–CTLA4 直接抑制T細(xì)胞活性；

3）臨床TMA隊(duì)列證實(shí)CCL22+DC與Treg豐度正相關(guān)（R=0.647）。

4、代謝-免疫互作機(jī)制

1）高脂飲食升高血清膽gu醇；

2）膽gu醇+LPS協(xié)同誘導(dǎo)“耗竭型"CCL22^+ DC，模擬體內(nèi)微環(huán)境。

5、中藥干預(yù)與分子靶點(diǎn)

1）SBJDD及其活性成分小檗堿顯著降低：

? CCL22^+ DC分化比例；

? TMEM131、TRAF2、TNFA表達(dá)；

? Treg浸潤(rùn)及Ki67^+增殖指數(shù)。

2）SPR提示小檗堿與TMEM131蛋白KD=5.03×10^-6 mol/L，阻斷TNF信號(hào)傳導(dǎo)。

四、研究結(jié)果

1、SBJDD顯著減少Apc^Min/+小鼠腺瘤/癌灶數(shù)量（↓65%）與體積（↓58%），降低組織學(xué)惡性度。

2、SBJDD重塑TME：CCL22+ DC比例下降70%，Treg下降55%，CD8+CTL功能恢復(fù)。

3、TMEM131是CCL22+DC分化的關(guān)鍵“開(kāi)關(guān)"：敲低后Ccl22、Cd80、Cd86表達(dá)下調(diào)，TNF信號(hào)通路受抑。

4、小檗堿直接結(jié)合TMEM131，抑制下游TRAF2–NF-κB–TNF軸，阻斷“耗竭型"DC產(chǎn)生。

5、臨床驗(yàn)證：SBJDD治療3個(gè)月后，患者腺瘤體積縮小，TME中CCL22+DC與Treg同步減少，與小鼠數(shù)據(jù)高度一致。

五、研究結(jié)論

本研究shou次從單細(xì)胞維度闡明：

1、結(jié)直腸“腺瘤-腺癌"演變過(guò)程中，膽gu醇代謝紊亂通過(guò)TMEM131–TNF信號(hào)軸驅(qū)動(dòng)Wdfy4+DC向免疫抑制性CCL22+DC分化，形成Treg富集的抑制性微環(huán)境；

2、中藥復(fù)方SBJDD及其核心成分小檗堿可直接靶向TMEM131，阻斷該分化軸，恢復(fù)DC抗原提呈功能，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)免疫抑制、抑制腫瘤發(fā)生。

該發(fā)現(xiàn)不僅揭示了CRC早期免疫—代謝互作新機(jī)制，也為利用天然多組分藥物精準(zhǔn)重塑TME、實(shí)現(xiàn)CRC化學(xué)預(yù)防提供了理論依據(jù)與候選策略。

六、中藥復(fù)方高分論文研究策略：

基于本研究的成功經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)四大黃金法則：

1、選題：中西醫(yī)結(jié)合痛點(diǎn)

切入點(diǎn)：

中醫(yī)優(yōu)勢(shì)病種（如癌前病變、慢性病）+國(guó)際熱點(diǎn)機(jī)制（腫瘤微環(huán)境、免疫代謝）。

本例：SBJDD防結(jié)直腸腺瘤復(fù)發(fā)（臨床優(yōu)勢(shì)）→ 聚焦DC-Tregs免疫軸（熱點(diǎn)機(jī)制）。

2、技術(shù)：前沿方法賦能

每一步環(huán)環(huán)相扣：如DC回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)反向驗(yàn)證SBJDD必要性，小檗堿貫穿“復(fù)方-成分-靶點(diǎn)"三級(jí)驗(yàn)證。

4、轉(zhuǎn)化：直擊臨床價(jià)值

明確臨床定位：SBJDD用于腺瘤階段防癌變（比治療晚期癌更具創(chuàng)新性）。

提供診斷標(biāo)志物：CCL22+DC可作為免疫微環(huán)境紊亂的“預(yù)警信號(hào)"。

5、中藥復(fù)方研究注意事項(xiàng)：

? 避坑指南：

避免“黑箱效應(yīng)"：不用“清熱解毒"抽象解釋，而是鎖定TMEM131-TNF通路。

拒絕數(shù)據(jù)堆砌：每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)直指核心問(wèn)題（如膽gu醇誘導(dǎo)DC耗竭呼應(yīng)高脂飲食致癌）。

? 高分標(biāo)配：

單細(xì)胞/空間組學(xué) + 分子互作驗(yàn)證（SPR/ITC）+ 臨床樣本驗(yàn)證。