一、電轉實驗技術原理與生物學基礎
1. 電穿孔的物理機制
膜電位改變：短時高壓電場（通常500–4000 V/cm）使細胞膜磷脂雙層發生極化，形成親水性臨時孔隙（直徑≈10 nm），持續時間毫秒級。
分子遞送機制：帶負電的DNA/RNA在電場驅動下以電泳方式穿過孔隙進入胞質，后續依賴細胞自身機制擴散至核內（核膜無有效電場作用，故“核電轉"為偽概念）。
可逆性與安全性：
可逆電穿孔：低強度脈沖后膜修復完整，細胞存活率>90%。
不可逆電穿孔：高強度脈沖致膜結構yong久破壞，用于腫瘤消融（非基因操作）。
2. 關鍵參數優化
| 參數 | 作用 | 典型值 |
|---|---|---|
| 電場強度 | 決定孔徑大小與細胞存活率 | 哺乳細胞：100–500 V/cm |
| 脈沖時長 | 影響分子滲透深度 | 1–10 ms |
| 脈沖波形 | 方波（均一滲透）vs 指數衰減波（能量漸變） | 方波為主 |
| 緩沖液離子濃度 | 高導電性介質增強電流效率，但需避免電解損傷 | 低鹽溶液（如Opti-MEM） |
注：物種差異性顯著，如小鼠受精卵需30V脈沖（3ms時長+97ms間隔，7循環）。
二、電轉實驗標準化操作流程
1. 體外電轉（以受精卵為例）
樣本制備：
收集受精卵（體內/體外受精），用低鹽緩沖液（如Opti-MEM）清洗3次，去除血清干擾。
電轉體系構建：
將受精卵與目標分子（如CRISPR/Cas9核糖核蛋白）混合，置于電轉杯或定制電極槽（如LF501PT1-10鉑金電極）。
脈沖施加：
優化參數（如小鼠：30V，3ms脈沖×7循環），脈沖間隔97ms避免過熱。
復蘇培養：
電轉后立即用M2培養基清洗，轉入KSOM培養液恢復，37℃/5% CO?孵育至囊胚期。
2. 體內電轉革新：i-GONAD技術
原理：跳過體外操作，直接對孕鼠輸卵管壺腹部施加電場，轉染體內受精卵。
流程：
孕鼠麻醉后暴露輸卵管。
注入外源DNA溶液至壺腹部。
定制電極夾住輸卵管施放電脈沖（參數同體外）。
優勢：
避免體外培養損傷，胚胎存活率提升20%。
已成功應用于小鼠、大鼠，潛力擴展至豬、猴。
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