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基因編輯陽性細(xì)胞篩選
更新時(shí)間：2025-08-02
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基因編輯陽性細(xì)胞篩選：技術(shù)策略與優(yōu)化流程
陽性細(xì)胞篩選是基因編輯的核心環(huán)節(jié)，其效率直接影響實(shí)驗(yàn)周期與成功率。
一、篩選目標(biāo)與挑戰(zhàn)
核心目標(biāo)
從混合細(xì)胞群中分離成功編輯的細(xì)胞（如基因敲除/KO、敲入/KI）。
排除野生型細(xì)胞干擾（未編輯細(xì)胞占比高時(shí)，易導(dǎo)致假陰性）。
關(guān)鍵挑戰(zhàn)
細(xì)胞損傷：長期篩選導(dǎo)致細(xì)胞老化（豬成纖維細(xì)胞傳代后增殖能力驟降）。
假陽性風(fēng)險(xiǎn)：部分編輯未wan全破壞基因功能（如移碼突變未致功能喪失）。
通量瓶頸：傳統(tǒng)單克隆培養(yǎng)需22天以上，且陽性率不足20%。
二、主流篩選技術(shù)及操作流程
（一）基于報(bào)告系統(tǒng)的富集技術(shù)
利用修復(fù)機(jī)制觸發(fā)熒光/抗性標(biāo)記表達(dá)，實(shí)現(xiàn)可視化和快速分選：
| 修復(fù)機(jī)制 | 報(bào)告系統(tǒng)設(shè)計(jì) | 篩選方法 | 優(yōu)勢(shì) | 案例 |
|---|---|---|---|---|
| NHEJ | 靶向破壞熒光蛋白終止子→恢復(fù)表達(dá) | FACS分選GFP?細(xì)胞 | 直觀高效，適用于KO | CRISPR-DIY載體 |
| HDR | 同源重組插入抗性基因（如Puro?） | 抗生素壓力篩選 | 適合KI，成本低 | 碧云天CRISPR質(zhì)粒 |
| SSA | 斷裂誘導(dǎo)單鏈退火修復(fù)→熒光蛋白重構(gòu) | 流式細(xì)胞術(shù) | 靈敏度高，脫靶率低 | 多重基因編輯驗(yàn)證 |
操作流程（以NHEJ-GFP系統(tǒng)為例）：
構(gòu)建含GFP-TAA終止子的編輯載體（sgRNA靶向TAA區(qū)域）。
轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，NHEJ修復(fù)破壞終止子→GFP表達(dá)。
72h后使用流式細(xì)胞儀（如iQue®）分選GFP?細(xì)胞。
（二）微量細(xì)胞快速鑒定法
突破性方案：僅需50個(gè)細(xì)胞即可完成基因型鑒定，縮短周期15天以上。
關(guān)鍵參數(shù)：
細(xì)胞量：≥50個(gè)（20細(xì)胞組檢出率不足，P<0.01）。
酶切靈敏度：T7E1可檢測(cè)≥5%的編輯效率。
驗(yàn)證步驟：Sanger測(cè)序確認(rèn)突變類型（如插入/缺失）。
（三）酶切與測(cè)序驗(yàn)證技術(shù)
| 方法 | 原理 | 適用場(chǎng)景 | 局限 |
|---|---|---|---|
| T7E1酶切 | 錯(cuò)配切割產(chǎn)生異源雙鏈 | 初篩（低成本） | 靈敏度低（≥5%編輯率） |
| Sanger測(cè)序 | 直接讀取序列變異 | 單克隆驗(yàn)證 | 通量低 |
| 高通量測(cè)序 | 深度覆蓋靶位點(diǎn)突變 | 多基因/脫靶分析 | 成本高 |
操作優(yōu)化：
混合克隆預(yù)篩：FA-PCR檢測(cè)群體編輯率，＞30%時(shí)再分選單克隆。
雙驗(yàn)證策略：T7E1初篩陽性克隆 → Sanger測(cè)序確認(rèn)（避免假陽性）。
三、技術(shù)選擇與場(chǎng)景適配
（一）按細(xì)胞類型選擇
| 細(xì)胞類型 | 推薦方法 | 理由 |
|---|---|---|
| 原代細(xì)胞 | 微量細(xì)胞鑒定法 | 避免長期培養(yǎng)致老化（豬成纖維細(xì)胞） |
| 腫瘤細(xì)胞系 | 抗生素篩選 + FACS | 增殖快，耐藥性穩(wěn)定 |
| iPSCs | HDR報(bào)告系統(tǒng) + 單克隆測(cè)序 | 維持多能性，需高精度編輯 |
（二）按編輯類型選擇
| 編輯類型 | 篩選技術(shù) | 關(guān)鍵指標(biāo) |
|---|---|---|
| 基因敲除（KO） | NHEJ-GFP報(bào)告系統(tǒng) | GFP?細(xì)胞占比（流式定量） |
| 基因敲入（KI） | 抗生素篩選 + PCR驗(yàn)證 | 抗性存活率 + 側(cè)翼序列擴(kuò)增 |
| 點(diǎn)突變（PM） | T7E1 + 深度測(cè)序 | 突變頻率＞90% |
基因編輯陽性細(xì)胞篩選
